2020年新冠病毒的侵襲，傳播方式主要通過(guò)口沫傳播、接觸傳播和氣溶膠傳播。如何切斷這些傳播途徑，要先研究新冠病毒的存活環(huán)境。目前，主要方式通過(guò)隔離觀察。那對(duì)于從事環(huán)保業(yè)務(wù)來(lái)說(shuō)，新冠病毒的存活時(shí)間是多久呢？讓我們通過(guò)一組實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。

　　近期，相關(guān)機(jī)構(gòu)對(duì)新冠病毒在廢水和水中的存活做過(guò)一組實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)主要如下：在過(guò)濾和未過(guò)濾的自來(lái)水(4℃和23℃)和廢水(23℃)中測(cè)定了代表性冠狀病毒貓傳染性腹膜炎病毒和人冠狀病毒229E的存活率。在相同的試驗(yàn)條件下，將其與脊髓灰質(zhì)炎病毒1型進(jìn)行了比較。試驗(yàn)水中冠狀病毒的失活高度依賴(lài)于溫度、有機(jī)物水平和拮抗細(xì)菌的存在。病毒效價(jià)下降99.9%(T99.9)所需的時(shí)間表明，在自來(lái)水中，冠狀病毒在23℃(10天)水中比在4℃(>100天)水中滅活得更快。冠狀病毒在廢水中迅速死亡，T99.9值在2～4天之間。除了4℃自來(lái)水外，脊髓灰質(zhì)炎病毒在所有測(cè)試水中的存活時(shí)間都比冠狀病毒長(zhǎng)。

　　材料和方法

　　貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)(ATCC-990)：一種貓科動(dòng)物的腸道冠狀病毒，在克蘭德?tīng)柪锷埬I細(xì)胞系(CRFK)(ATCC-94)中繁殖和檢測(cè)。人冠狀病毒229E(HCoV)(ATCC-740)：一種呼吸道病毒，在胎兒肺成纖維細(xì)胞，MRC-5細(xì)胞系(ATCC-171)中繁殖和分析。脊髓灰質(zhì)炎病毒1LSc-2ab(PV-1)：一種已知的在環(huán)境中非常穩(wěn)定的人類(lèi)腸道病毒，在布法羅綠猴腎(BGM)細(xì)胞系中繁殖和檢測(cè)。在單層細(xì)胞中觀察到細(xì)胞致病作用(CPE)后，將感染細(xì)胞在-20℃冷凍和解凍三次以釋放病毒。隨后在1000g離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，加入到9%聚乙二醇(相對(duì)分子質(zhì)量8000)和0.5M氯化鈉的病毒懸浮液中，并在4℃下攪拌過(guò)夜。在10000g離心30分鐘后，用0.01M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;pH7.4)(Sigma,St.Louis,MO)重懸至原始病毒懸液體積的5%。然后將冠狀病毒進(jìn)行效價(jià)測(cè)定并儲(chǔ)存在-80℃下。脊髓灰質(zhì)炎病毒通過(guò)用等體積的VertrelXF(Dupont,Wilmington，DE)提取進(jìn)一步純化，乳化后以7500g離心15分鐘，隨后收集頂層水層，進(jìn)行效價(jià)測(cè)定并在-80℃儲(chǔ)存。

　　自來(lái)水樣本是從實(shí)驗(yàn)室的冷水龍頭中采集的。水源是地下水，水質(zhì)參數(shù):pH7.8，溶解固體297mg/L，總有機(jī)碳0.1mg/L。在收集樣品之前，讓水流動(dòng)3分鐘。在未過(guò)濾的自來(lái)水和通過(guò)0.2μm孔徑過(guò)濾器去除細(xì)菌的自來(lái)水中測(cè)定病毒存活率。將自來(lái)水(30mL)加入到無(wú)菌的50mL聚丙烯離心管中，以減少附著在容器上的病毒損失。添加無(wú)菌硫代硫酸鈉至最終濃度33μg/mL，以使水脫氯。渦旋后，將病毒添加到每個(gè)管中，最終濃度為105TCID50/mL。再次渦旋離心管并立即取樣(零時(shí)間點(diǎn))。然后將離心管儲(chǔ)存在4℃或室溫下(23℃)。室溫下儲(chǔ)存的離心管用鋁箔覆蓋，以防暴露在光線下。在1、3、6、10、15和21天后對(duì)離心管取樣，并將樣品在-80℃下冷凍，直到它們?cè)诩?xì)胞上被分析。初級(jí)出水和剩余活性污泥(二級(jí))的樣品來(lái)自于美國(guó)亞利桑那州圖森市羅杰路污水處理廠，并收集在無(wú)菌聚丙烯瓶中。沉淀后收集初級(jí)出水，氯化前收集二級(jí)出水。該設(shè)施一級(jí)出水的典型水質(zhì)參數(shù)為生物需氧量(BOD)和1懸浮固體(10～220mg/L)。

　　通常相比初級(jí)出水，二級(jí)出水中的BOD和懸浮固體減少了90%～95%。將出水(30mL)加入到無(wú)菌的50mL聚丙烯離心管中。在添加病毒之前，一級(jí)出水通過(guò)0.2μm孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾，并且未經(jīng)過(guò)濾的也進(jìn)行測(cè)試。二級(jí)出水僅未經(jīng)過(guò)濾的進(jìn)行測(cè)試。然后將病毒添加到每個(gè)離心管中，最終濃度為105TCID50/mL。將離心管渦旋，立即取樣(零時(shí)間點(diǎn))。然后將離心管覆蓋并保持在室溫(23℃)。在1、2、3、6、10、15和21天后收集樣品，并將樣品在-80℃下冷凍直至分析。使用噬斑試驗(yàn)或TCID50技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)物上計(jì)數(shù)病毒。在6孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板中，通過(guò)噬斑測(cè)定法(PaymentandTrudel1993)測(cè)定了PV-1的效價(jià)。這是一種直接定量方法，最低檢測(cè)限為10pfu/mL。將每種稀釋液接種在兩個(gè)孔中。在細(xì)胞培養(yǎng)中不形成斑塊的冠狀病毒，通過(guò)組織培養(yǎng)感染劑量50%技術(shù)(TCID50)在24孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板中測(cè)定其效價(jià)(PaymentandTrudel1993)。這種技術(shù)確定了顯示出CPE的50%的原液的稀釋度。取稀釋倍數(shù)的反對(duì)數(shù)，得到每毫升TCID50的病毒效價(jià)。該方法的最低檢測(cè)值為每毫升3.7個(gè)病毒。將每種稀釋液接種在至少8個(gè)孔中。在添加病毒之前，任何來(lái)自測(cè)試水的樣品都必須在細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)之前過(guò)濾，以消除細(xì)菌污染。在pH為7下使3%牛肉提取物(BectonDick-inson，Sparks，MD)通過(guò)以阻斷可能吸附病毒的位點(diǎn)來(lái)制備具有聚醚砜(PES)膜的0.2μm低蛋白結(jié)合Millex過(guò)濾器(Millipore,Billerica,MA)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。03

　　結(jié)果和討論

　　表1顯示了三種病毒在測(cè)試水中的存活天數(shù)。每種病毒的對(duì)數(shù)減少量由公式“l(fā)gN/N0”計(jì)算，其中N是指定日期的病毒效價(jià)，N0是時(shí)間為0的病毒效價(jià)。線性回歸的斜率用于確定存活率；病毒效價(jià)下降99%和99.9%所需的時(shí)間(分別表示為T(mén)99和T99.9)。

　　影響病毒在水中存活的因素包括溫度、有機(jī)物和好氧微生物(JohnandRose2005;MelnickandGerba1980;SobseyandMeschke2003)。對(duì)病毒存活最關(guān)鍵的影響因素就是溫度。已有研究表明，病毒存活率隨著溫度的升高而降低，這主要是由蛋白質(zhì)變性和胞外酶活性增加引起的(Hurstetal.1980;JohnandRose2005)。自來(lái)水研究的結(jié)果證實(shí)冠狀病毒就是這種情況。通過(guò)測(cè)試過(guò)濾后的自來(lái)水，我們減少或消除了顆粒有機(jī)物和細(xì)菌的影響。在室溫下，只需要10天就能使過(guò)濾后的自來(lái)水中的冠狀病毒減少99.9%，而在4℃時(shí)，這種程度的病毒滅活則需要100天以上。PV-1在自來(lái)水中4℃的存活與冠狀病毒相似，但在室溫(23℃)下，該病毒在過(guò)濾水和未過(guò)濾水中的存活時(shí)間都延長(zhǎng)了六倍。圖1和圖2分別顯示了三種研究病毒在室溫(23℃)和4℃下在自來(lái)水中的存活情況。隨著時(shí)間的推移，病毒效價(jià)從4℃水中的初始效價(jià)上升，這可能是由于病毒傾向于形成聚集物然后分解，而不是由于病毒在樣本中的復(fù)制。

　　圖1室溫（23℃）條件下三種病毒在脫氯、過(guò)濾后自來(lái)水中的對(duì)數(shù)減少量

　　圖24℃條件下三種病毒在脫氯、過(guò)濾后自來(lái)水中的對(duì)數(shù)減少量（*代表未過(guò)濾）

　　水中有機(jī)物和懸浮固體的存在可以為吸附在這些顆粒上的病毒提供保護(hù)，但同時(shí)如果這些固體沉淀下來(lái)，也可以成為去除病毒的一種機(jī)制。從自來(lái)水到二級(jí)出水再到一級(jí)出水，測(cè)試水中的有機(jī)物和懸浮固體含量都有所增加。過(guò)濾后的自來(lái)水比未過(guò)濾的自來(lái)水對(duì)冠狀病毒滅活作用更強(qiáng)。此外，HCoV在未過(guò)濾的一級(jí)出水中的存活時(shí)間比過(guò)濾后的長(zhǎng)。這表明較高的固體含量確實(shí)為水中的冠狀病毒提供了保護(hù)。然而，對(duì)PV-1來(lái)說(shuō)，過(guò)濾對(duì)其在自來(lái)水中的存活影響很小。在一級(jí)出水中，經(jīng)過(guò)濾出水中的PV-1存活時(shí)間是未經(jīng)過(guò)濾出水中的三倍。值得注意的是，在添加到廢水中的時(shí)間和立即回收用于測(cè)試的時(shí)間(零時(shí)間點(diǎn))之間，冠狀病毒的效價(jià)顯著降低。加入廢水后，冠狀病毒的效價(jià)立即下降了99.9%，而PV-1效價(jià)僅下降了10%。這種減少可能是由于廢水中溶劑和洗滌劑的存在，它們會(huì)破壞病毒包膜并最終使病毒失活。

　　這也可能表明冠狀病毒比PV-1更容易吸附廢水中的固體。病毒包膜的疏水性使得冠狀病毒在水中的溶解性降低，因此增加了這些病毒粘附在固體上的可能性。廢水樣本必須經(jīng)過(guò)過(guò)濾，以防止細(xì)菌污染細(xì)胞單層，這將去除顆粒物和任何與之相關(guān)的病毒。捕食性微生物如原生動(dòng)物的存在可以增加水中病毒的失活率，蛋白酶和核酸酶也有這種作用(Gerbaetal.1978;JohnandRose2005)。與二級(jí)出水相比，初級(jí)出水的細(xì)菌和固體含量都較高。所有三種測(cè)試病毒在未過(guò)濾的初級(jí)出水中的存活時(shí)間都比未過(guò)濾的二級(jí)出水長(zhǎng)，盡管對(duì)FIPV來(lái)說(shuō)這是可以忽略的。這再次表明，廢水中的顆粒物相關(guān)病毒受到保護(hù)，不會(huì)被捕食和滅活。然而，冠狀病毒在3天后低于最低檢測(cè)限，而PV-1在21天后仍可檢測(cè)到。廢水中研究病毒的平均對(duì)數(shù)減少結(jié)果列于表2。

　　結(jié)論

　　這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，冠狀病毒比PV-1對(duì)溫度更敏感，并且PV-1和冠狀病毒在廢水中的存活性有相當(dāng)大的差異。其部分可能原因是包膜病毒在環(huán)境中不如非包膜病毒穩(wěn)定。冠狀病毒在廢水中很快死亡，在2～3天內(nèi)減少了99.9%，這與SARS-CoV存活數(shù)據(jù)相當(dāng)(Wangetal.2005a,b)。冠狀病毒在初級(jí)出水中的存活時(shí)間僅略長(zhǎng)于二級(jí)出水，這可能是因?yàn)閼腋」腆w含量較高，可以防止其失活。PV-1比冠狀病毒存活時(shí)間長(zhǎng)得多，初級(jí)出水需要10天，二級(jí)出水需要5天，才能達(dá)到與冠狀病毒相當(dāng)?shù)臏缁盥省１狙芯勘砻?，冠狀病毒在水環(huán)境中的傳播要比腸道病毒少，因?yàn)樵诃h(huán)境溫度下，冠狀病毒在水中和廢水中會(huì)更快地失活。